32 metų saugas Milano klubo gretas papildė 1995 metais ir praleido jame visą savo karjerą, išskyrus 1997-1998 metų sezoną, kuomet buvo paskolintas "Vicenza" komandai.
Su "Rossoneri" Ambrosini triskart tapo Italijos čempionu, dukart triumfavo UEFA Čempionų lygoje, taip pat Europos Super Taurės varžybose.
Pasibaigus praėjusiam sezonui karjerą baigus legendiniam Paolo Maldini naujuoju kapitonu buvo paskirtas Ambrosini.